執(zhí)照.jpg)
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| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) | |
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人全血單個核細(xì)胞分離液說明書
【包裝規(guī)格】
200ml/瓶
【實驗前準(zhǔn)備】
A． 適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機
B． 耗材
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)地 |
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15ml 離心管散裝 | 339650 | 美國 NUNC |
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15ml 離心管架裝 | 339651 | 美國 NUNC |
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50ml 離心管散裝 | 339652 | 美國 NUNC |
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50ml 離心管架裝 | 339653 | 美國 NUNC |
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無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
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【檢驗方法】 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。 首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：
一、 使用 15ml 離心管時：
情況 A：血液樣本量小于 3ml 時，實驗方法如下：
1. 取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。
3. 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
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| 本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測 | |
| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) | |
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8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時，實驗方法如下：
1. 取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1000g）。
3. 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
二、 使用 50ml 離心管時：
情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時，實驗方法如下：
1. 取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
3. 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
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| 本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測 | |
| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) | |
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8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時，實驗方法如下：
1. 取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，650-110g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
3. 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
【注意事項】
1. 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實驗結(jié)果， 在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實驗，血液存放時間越長，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2. 本實驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3. 吸取過多的單個核細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的
粒細(xì)胞數(shù)量增加。
4. 吸取過多的單個核細(xì)胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5. 如所實驗后細(xì)胞得率或活性過低，請以尋求幫助，具體 詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
6. 當(dāng)血液樣本粘度過高需稀釋時，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：
2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞档图?xì)胞得率及活性。如血液樣
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| 本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測 |
| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) |
本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時間。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】
本實驗淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
| 紅細(xì)胞 |
| 白細(xì)胞 |
| 血小板 |
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| （4.0-10.0）×109 |
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| （4.0-5.5）×1012 |
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| （1.0-3.0）×1011 |
含量（個/L） | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | ||
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| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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【相關(guān)實驗技術(shù)方案】 |
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1. 所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2. 所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3. 所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù) 注：上述技術(shù)方案詳情請登陸本搜索“細(xì)胞
分離、純化、擴增及鑒定指導(dǎo)手冊”，并在說明書項目欄下下載使用。 【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
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離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
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離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 |
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離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
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離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細(xì)胞密度過小 |
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2. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
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| 本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測 |
| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) |
區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離
心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效 果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。
